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在綜合考慮靈敏度、易用性和成本時(shí)，Elispot平臺(tái)很可能成為科研、治療和診斷領(lǐng)域開發(fā)多功能T細(xì)胞分析的上乘之選，在zui近方興未艾的細(xì)胞免疫治療方法開發(fā)中再獲關(guān)注。

在體外T細(xì)胞效應(yīng)功能研究中，zui常用的分析包括流式細(xì)胞分析、Elispot、ELISA、多重微球芯片（又稱為多因子檢測(cè)或液相芯片等）和定量PCR。雖然每種分析都有著特定的優(yōu)點(diǎn)和限制，但Elispot分析具有明顯的優(yōu)勢(shì)：ELISpot就像基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS），能直接確定抗原（Ag）特異的T細(xì)胞頻率——而這正是免疫診斷的核心競(jìng)爭(zhēng)力。

這樣的分辨能力是上清分析所無法達(dá)到的，如ELISA或多重微球芯片，它們的測(cè)定是基于特定樣品孔中所有細(xì)胞產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子。在急性HIV患者中，產(chǎn)生IFNγ以應(yīng)答共同回憶抗原（如TT或PPD）的細(xì)胞頻率與健康個(gè)體相當(dāng)，而斑點(diǎn)尺寸大大降低。這一結(jié)果表明，HIV特異的T細(xì)胞功能受到損傷，而非細(xì)胞數(shù)量減少。

同樣地，與“舊的”記憶T細(xì)胞相比，zui近體內(nèi)激活的T細(xì)胞可能表現(xiàn)出每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞因子生產(chǎn)量有所增加。區(qū)分長(zhǎng)期記憶亞群和zui近激活亞群的能力對(duì)自身免疫性疾病和慢性感染的T細(xì)胞診斷很有意義。大量分析結(jié)果被先天免疫系統(tǒng)的背景信號(hào)所混淆?？乖禺悜?yīng)答的稀釋導(dǎo)致整個(gè)信號(hào)峰變得扁平，而這個(gè)問題在檢測(cè)罕見群體的存在時(shí)影響zui大，例如PBMC中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）或骨髓中的散布腫瘤細(xì)胞，它們都是轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志物。

已知T細(xì)胞能夠識(shí)別幾乎無限數(shù)量的可感染物質(zhì)并且同時(shí)能將它們與自身區(qū)分開來，總的初始細(xì)胞庫包含≥1012種*的T細(xì)胞受體（TCR）特異性。因此，在不存在感染時(shí)，特異識(shí)別一種抗原的循環(huán)記憶細(xì)胞的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)?shù)偷模ǔＴ?:10,000 -1,000,000。要檢測(cè)如此罕見的細(xì)胞，對(duì)于靈敏度的下限僅為0.02%的流式平臺(tái)來說*無法勝任。

而那些以培養(yǎng)上清檢測(cè)細(xì)胞因子的方法，如果液相芯片或ELISA，因周圍環(huán)境對(duì)分析物的稀釋、周圍細(xì)胞的吸收以及酶的降解，其檢測(cè)靈敏度會(huì)被進(jìn)一步降低。相比之下，Elispot分析顯示出每100萬個(gè)PBMC中不到25個(gè)生產(chǎn)IFNγ的T細(xì)胞的檢測(cè)閾值（0.0025%）；這相當(dāng)于檢測(cè)靈敏度提高了近10倍。Elispot分析的高靈敏度對(duì)過敏研究也很重要，其中鑒定極低頻率的Th2產(chǎn)細(xì)胞因子細(xì)胞對(duì)疾病監(jiān)控和免疫療法的開發(fā)都很關(guān)鍵。特別是在流式細(xì)胞儀和ELISA平臺(tái)上都已證實(shí)不足以檢測(cè)的IL-4，而這正是Th2驅(qū)動(dòng)應(yīng)答的主要指標(biāo)。

Elispot分析的開發(fā)始于1983年，是以平板為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）和以膜為基礎(chǔ)的Western blotting技術(shù)的融合，可實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌的分析對(duì)象。與標(biāo)準(zhǔn)的聚苯乙烯表面相比，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜大大改善了抗體結(jié)合特性，更強(qiáng)的結(jié)合膜表面具有更高的Ab密度，帶來更明確的斑點(diǎn)。微孔板形式則進(jìn)一步提高了操作通量，也容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；更多樣品，更多刺激條件，或更多不同的細(xì)胞因子可在相鄰孔中同時(shí)平行。Elispot是可實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)功能（如細(xì)胞因子的釋放）定量分析的少數(shù)幾種技術(shù)之一。

流式細(xì)胞儀剛剛啟動(dòng)時(shí)會(huì)有不少樣品損失，與之不同，Elispot中的每個(gè)細(xì)胞都會(huì)被測(cè)定。Elispot 需要的細(xì)胞數(shù)僅為流式分析的十分之一，這對(duì)于那些珍貴的（如遠(yuǎn)程取樣）和/ 或有限的（如細(xì)胞治療病人，小兒或免疫抑制檢測(cè)的受試者）的樣品至關(guān)重要。96孔板一直存在一個(gè)問題，即小規(guī)模分析中浪費(fèi)了未使用的孔，比如單個(gè)患者樣品的診斷分析。默克生命科學(xué)特別提供了8聯(lián)管（目錄號(hào)M8ips4510），這種聯(lián)管是透明的，適合FluoroSpot應(yīng)用，以及標(biāo)準(zhǔn)的酶學(xué)分析，表現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)96孔板相當(dāng)。

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ELISpot技術(shù)極為靈敏，但對(duì)操作經(jīng)驗(yàn)有一定的要求。在此，默克生命科學(xué)基于開發(fā)這個(gè)技術(shù)所積累的經(jīng)驗(yàn)，為您用好這個(gè)免疫細(xì)胞檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)提供非常有用的Tips，助您獲得而有意義的數(shù)據(jù)。 （生物谷 bioon.com）侵刪