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血小板計(jì)數(shù)的參考方法

Reference method for plaet counting

WS/T  244-2005 
  
前  言 
 
為了保證血小板的計(jì)數(shù)結(jié)果具有溯源性和準(zhǔn)確性，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。 

本標(biāo)準(zhǔn)從2005年5月16日起實(shí)施。 本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。 

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：彭明婷、申子瑜、陸紅、谷小林、楊振華。 

本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)解釋。

1 范圍 

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血小板計(jì)數(shù)參考方法的技術(shù)要求。 

本標(biāo)準(zhǔn)適用于建立血小板計(jì)數(shù)參考方法的實(shí)驗(yàn)室。 

2 規(guī)范性引用文件 

血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）-2001  血小板計(jì)數(shù)的參考方法

3 定義 

   參考方法（Reference method） 

一種可清楚和準(zhǔn)確描述的用于特定檢測(cè)的技術(shù)，該技術(shù)要有依據(jù)，可提供足夠準(zhǔn)確和精密的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以評(píng)價(jià)其他實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準(zhǔn)確性必須與決定性方法進(jìn)行比較。參考方法應(yīng)溯源至一級(jí)計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)并且須標(biāo)示不準(zhǔn)確度和不精密度。 

4 總則 

4．1  本標(biāo)準(zhǔn)采用間接法計(jì)數(shù)血小板（Plaet， PLT）。即用熒光標(biāo)記PLT后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅細(xì)胞（Red blood cell，RBC）和PLT的比值，同時(shí)用單通道阻抗原理的半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀準(zhǔn)確計(jì)數(shù)RBC，用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT的計(jì)數(shù)值。 

4. 2  為了保證參考方法檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，建立參考方法的實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行比對(duì)。 

5 血小板計(jì)數(shù)參考方法的原理 

首先將EDTA抗凝血標(biāo)本用無(wú)菌緩沖液進(jìn)行預(yù)稀釋，再用特定的熒光抗體對(duì)PLT進(jìn)行染色。溶液中已染色的血小板被稀釋成計(jì)數(shù)濃度，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板和紅細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度將閾值設(shè)在可從RBC中區(qū)分PLT的位置，以檢測(cè)出RBC和PLT的比值。用RBC的計(jì)數(shù)值除以RBC/PLT的比值計(jì)算出PLT計(jì)數(shù)值。 

6 血標(biāo)本 

6．1  用合乎要求的塑料注射器或真空采血系統(tǒng)采集健康人的靜脈血標(biāo)本。 

6．2   標(biāo)本的收集要求使用EDTA二鉀為抗凝劑，抗凝劑的濃度為3.7至5.4 umol/ml血 （1.5~2.2 mg/ml 血）。 

6．3  盛有標(biāo)本的試管應(yīng)有足夠的剩余空間以便于血標(biāo)本的混勻操作。 

6．4  標(biāo)本中不能有肉眼可見(jiàn)的溶血或小凝塊。 

6．5  標(biāo)本置于18℃~22℃ 室溫條件下，取血后4小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)。 

6．6  為了保證RBC和PLT分布的均一性，在預(yù)稀釋和加標(biāo)記抗體前動(dòng)作輕柔地將采血管反復(fù)顛倒，充分混勻標(biāo)本。勿使用混勻器對(duì)標(biāo)本進(jìn)行混勻。 

7 容器和器皿 

為避免血小板黏附于儲(chǔ)存容器或稀釋器皿上，在標(biāo)本檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程中必須使用聚丙烯或聚苯乙烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。 

8 儀器的性能 

8．1 使用流式細(xì)胞儀，通過(guò)前向角散射光和熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)PLT和RBC。儀器在檢測(cè)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的直徑為2μm的球形顆粒時(shí)必須有足夠的敏感度。

8．2 用半自動(dòng)、單通道、阻抗原理的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)RBC，儀器小孔管的直徑為80~100μm，小孔的長(zhǎng)度為直徑的70%至100%，計(jì)數(shù)過(guò)程中吸入稀釋標(biāo)本體積的準(zhǔn)確度在1%以內(nèi)（溯源至國(guó)家或計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)）。

9 試劑 

9．1 稀釋液：用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，濃度為0.01mol/L，pH值7.2~7.4，含0.1%的牛血清白蛋白（BSA），配制方法如下： 

9.1.1 將1.15g無(wú)水磷酸氫二鈉（Na2HPO4；化學(xué)分析純，；分子量為142.0）加到約750ml去離子水或蒸餾水中并使之溶解。 

9.1.2 向210mg磷酸二氫鉀 (KH2PO4 ；化學(xué)分析純，分子量為136.1)，8.0g氯化鈉（NaCl；化學(xué)分析純，分子量為58.44），200mg氯化jia（KCl；化學(xué)分析純，分子量為74.55）和1.0 g BSA的混合物中加入去離子水或蒸餾水至1000ml。保存于4℃~8℃條件下。

9.1.3 用低附著性的平均孔徑在0.20~0.25μm之間的濾膜過(guò)濾。 

9．2 染液：使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD41和CD61抗體，這兩種抗體可以與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物結(jié)合，用于檢測(cè)血小板。 
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確認(rèn)該批號(hào)抗體是否能得到足夠的染上熒光的血小板。抗體應(yīng)能得到足夠高的血小板的熒光信號(hào)以便通過(guò)log FL1(528nm處的熒光強(qiáng)度)對(duì)log FS (前向角散射光)的圖形分析，將血小板從噪聲、碎片和RBC中分辨出來(lái)。

10 檢測(cè)過(guò)程 

10.1 用加樣器加5μl充分混勻（至少輕柔顛倒標(biāo)本管8次）的血標(biāo)本于100μl已過(guò)濾的PBS-BSA稀釋液中。 

10.2 加5μl CD41抗體和5μl CD61抗體染液，在室溫18℃~22℃、避光條件下放置15分鐘。 

10.3 15分鐘后，加4.85ml PBS-BSA稀釋液制備成1:1000的稀釋標(biāo)本，輕輕顛倒混勻以保證PLT和RBC充分混勻。 

10.4 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，應(yīng)至少檢測(cè)5000個(gè)信號(hào)，其中PLT應(yīng)多于1000。流式細(xì)胞儀的設(shè)定必須保證每秒計(jì)數(shù)少于3000個(gè)信號(hào)。如果同時(shí)收集到RBC散射光的信號(hào)和血小板的熒光信號(hào)應(yīng)被視為RBC-PLT重疊，計(jì)數(shù)結(jié)果將被分別計(jì)入RBC和PLT。 
直方圖或點(diǎn)圖均可被采用，但推薦使用點(diǎn)圖。檢測(cè)過(guò)程中推薦使用正向置換移液器。     

11  RBC濃度的計(jì)數(shù)法 

據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T XXX-2003：紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的參考方法。 

12 血小板計(jì)數(shù)值的確定 

使用流式細(xì)胞儀確定RBC/PLT的比值 R=RBC/PLT 
用RBC數(shù)除以R值得到PLT計(jì)數(shù)值 

13 重疊 

一旦設(shè)定了理想的檢測(cè)條件，則不須再次進(jìn)行重疊計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)。 

14 不精密度 

血小板檢測(cè)結(jié)果的不精密度（CV）要求≤3%。