久久久影院,五月婷婷色77,久久亚洲电影精品,欧美另类一区二区三区在线

蛋白-蛋白相互作用是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中zui重要的方面之一。GST pull-down將靶蛋白與GST融合表達(dá)，并將蛋白固化在谷胱甘肽(GSH)親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后通過電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。 

    "誘餌蛋白"和"捕獲蛋白"均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。 

GST pull-down一般指用一個帶GST tag的重組蛋白，與目的蛋白進(jìn)行孵育，zui后用結(jié)合GST的Beads拉下相互作用復(fù)合物。co-IP一般是用某一蛋白的抗體，在細(xì)胞裂解液中與相應(yīng)的蛋白結(jié)果，用Protein A/G將抗原抗體復(fù)合物拉下，zui后在拉下的復(fù)合物中檢測目的蛋白的實驗。二者都是用于檢測蛋白相互作用的實驗。區(qū)別是pull-down一般是驗證in vitro相互作用；co-IP一般用于檢測細(xì)胞水平的in vivo相互作用。特殊的，也有人在重組蛋白水平，利用抗原抗體的反應(yīng)，來進(jìn)行pull-down實驗。但這種方法文獻(xiàn)里用得很少，而且，該屬于pull-down還是co-IP，本人沒看到明確定義，個人認(rèn)為應(yīng)該屬于pull-down。 

谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase GST)Pull-down實驗技術(shù)是用來鑒定蛋白間相互作用的體外實驗技術(shù)之一。該技術(shù)的原理是，首先構(gòu)建靶蛋白和GST的融合基因，導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，然后提取靶蛋白-GST融合蛋白，并將其固定在谷胱甘肽親和樹脂上后充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，將含有目的蛋白的溶液過柱，利用親和層析純化目的蛋白，從而在目的蛋白溶液中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），這種結(jié)合物經(jīng)過梯度洗脫后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。 

GST親和層析和GST Pull-down方法基本原理是：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH(Glutathione)親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離。在病毒受體研究中，融合蛋白通常設(shè)計為病毒吸附蛋白(VAP)。這方面成功的例子有HBV。具體做法如下：將GST-融合探針蛋白(VAP)和GTH-Sepharose制成親和層析柱，然后待分析的蛋白質(zhì)混合液流經(jīng)親和層析柱，梯度洗脫，分離、收集各蛋白組分，這稱為GST親和柱層析(GST affinity column chromatography)。如果一開始待檢蛋白就和GST-融合探針蛋白與GTH-Sepharose一起共同孵育，經(jīng)離心收集洗脫復(fù)合物和洗滌后，再加入過量GTH獲得相互作用蛋白的復(fù)合物，那么這種方法則稱為GST pull down。GST親和層析及相應(yīng)的GST Pull-down方法的優(yōu)點(diǎn)是敏感，對混合物中的所有蛋白均“一視同仁”， 也可用于受體功能的鑒定。缺點(diǎn)是GST有可能影響融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，另外，蛋白質(zhì)濃度對實驗也有一定影響。 

酵母雙雜交技術(shù)：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可獨(dú)立存在的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則可特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個原理，人們將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用就會使AD與BD形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。 

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個部分組成：

• 與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)；

②AD融合的蛋白表達(dá)載體，其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)；

③帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因，有利于雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用系統(tǒng)中BD來源主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因BD來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現(xiàn)。近年來，開始出現(xiàn)了應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行病毒受體研究的成功報告，如麻疹病毒的絨猴細(xì)胞受體。李凌云等構(gòu)建了表達(dá)“獵物”(prey)蛋白的質(zhì)粒和表達(dá)病毒VAP“誘餌”(bait)蛋白的質(zhì)粒，然后共轉(zhuǎn)染同一酵母細(xì)胞，利用已建立的易感細(xì)胞cDNA文庫，篩到了陽性克隆。酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性較好，缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且對蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位有要求。為了克服上述缺點(diǎn)，人們進(jìn)一步優(yōu)化出所謂“雙篩選系統(tǒng)”，即蛋白質(zhì)相互作用必須同時激活兩個以上報道基因，具有兩種以上的相應(yīng)表型才算是真的陽性結(jié)果。另外，人們也改造了酵母雙雜交系統(tǒng)所用的載體系統(tǒng)，將在細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上進(jìn)行，以此來更容易地篩選膜蛋白受體，如Ras recruitment system(RRS)。 

GST-pulldown操作流程 材料及試劑 

探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細(xì)胞蛋白，或者組織蛋白提取物  細(xì)胞蛋白裂解液，

洗脫液： PBS及PBS+1%Triton-100 

PBS (1L) 

NaCl：   8g 

KCl：    0.2g 

Na2HPO4： 1.44g 

KH2PO4：  0.24g

加入800ml蒸餾水，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，zui后加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存?zhèn)溆茫?nbsp;

PMSF  MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲存濃度100mM，將0.174g PMSF溶于10ml無水乙醇混勻即可！保持于-20℃或者4℃ 

（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達(dá)蛋白B相互作用） 

1 · 原核融合蛋白A的獲得 

1.1 將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)?；D(zhuǎn)BL21(DE3)菌株 

1.2 挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養(yǎng)過夜 

1.3 將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間（誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細(xì)菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置O/N 

1.4 室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細(xì)菌裂解液(BS+1%Triton-100+PMSF)吹打混勻 

1.5 冰上超聲破碎，開2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼 1.6 11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清，-80℃保存?zhèn)溆?nbsp;

2 真核融合蛋白B的獲得 

2.1 將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達(dá)載體上，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染 xq 

3 · 48小時后，取適量融合蛋白GST-A于冰上凍融 

4 · 取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時。 

5 · PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul(PBS+Beads)作Offer。 

6 · 同時，裂解真核融合蛋白B，去盡培養(yǎng)基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。 

7 · 吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。 

8 · BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補(bǔ)足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N。 

9·  PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 

10·  40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run -SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot。