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DNA測序技術(shù)是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù),它的出現(xiàn)極大地推動了生物學(xué)的發(fā)展。成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀70年代中期。1977年Maxam和Gilbert報道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法。同一時期,Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法。20世紀90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序的時代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為*代DNA測序技術(shù)。
*代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計劃(humangenomeprojec,tHGP)主要基于*代DNA測序技術(shù)。目前基于熒光標記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀仍被廣泛地應(yīng)用。
Sanger法因操作簡便,得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù),其中極為重要的是熒光自動測序技術(shù)。
熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理,用熒光標記代替同位素標記,并用成像系統(tǒng)自動檢測,從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。早在1985年,Smith等采用激光激發(fā)標記的熒光,并用CCD檢測,比常規(guī)電泳測序速度提高9倍,測序速度達到8000bp/h以上。
20世紀80年代初Jorgenson和Lukacs提出了毛細管電泳技術(shù)(capillaryelectrophoresis)。1992年美國的Mathies實驗室首先提出陣列毛細管電泳(capillaryarrayelectrophoresis)新方法,并采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置,25只毛細管并列電泳,每只毛細管在15h內(nèi)可讀出350bp,DNA序列分析效率可達6000bp/h。1995年Woolley研究組用該技術(shù)進行測序研究,使用四色熒光標記法,每個毛細管長35cM,在9min內(nèi)可讀取150個堿基,準確率約97%。
目前,應(yīng)用廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems,ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術(shù)的DNA測序儀。如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管,4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記,在通過毛細管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā),發(fā)出不同顏色的熒光,被CCD檢測系統(tǒng)識別,并直接翻譯成DNA序列。
Sanger測序是DNA測序技術(shù)的金標準,曾在人類基因組計劃中發(fā)揮了關(guān)鍵推動作用,并且現(xiàn)在仍被用來獲得高度準確且可信賴的測序數(shù)據(jù)。