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 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 操作步驟

1、挑取 LB 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于 20ml LB(含

Amp100ug/ml)液體培養(yǎng)基中，37℃、250rmp 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約

12-14hr)。

2、取 1.5ml 培養(yǎng)液倒入 1.5ml eppendorf 管中，12000rmp 離心1-2min。棄上清，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體盡可能流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。),室溫下放置 5-10 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒 eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩)，冰浴5 min，使細(xì)胞膜裂解(溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖海孰x心管中菌液逐漸變清)。

5、加入 150μl 預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，可在冰上放置 5min。 12000rmp 離心 10min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí) K+使 SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

6、上清液移入干凈 eppendorf 管中，加入等體積的酚/氯f(wàn)ang/異戊醇，振蕩混勻, 12000rmp 離心 10min。(450μl 的苯酚/氯f(wàn)ang/異戊醇)

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入 2 倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心 12000rmp×10min。

8、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次，12000rmp 離心 5 min。

9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，約4μl) 中，37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

實(shí)驗(yàn)試劑及配制

1、LB 液體培養(yǎng)基

稱(chēng)取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g， NaCl 10g，溶于 800ml 蒸餾水中，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5，加水至總體積 1 升，高壓下蒸氣滅菌 15 分鐘。

2、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml 水溶液， -20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

3、溶液Ⅰ50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。

配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至 500ml。在 121℃高壓滅菌 15min ，貯存于 4℃。

4、溶液Ⅱ0.2M NaOH，1% SDS

配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加 ddH2O 至 10ml。使用前臨時(shí)配置。

5、溶液Ⅲ：醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8

配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH2O 至 500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

苯酚/氯f(wàn)ang/異戊醇(25：24：1)

氯f(wàn)ang可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯f(wàn)ang均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。

無(wú)水乙醇

70%乙醇

TE：

10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml ， 0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml，加 ddH₂O 至 100ml。121℃高壓濕熱滅菌 20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1M Tris-HCl(Tris(三羥甲基)氨基甲烷)：800ml H₂O 中溶解 121g Tris 堿，用濃鹽酸調(diào) pH 值，混勻后加水到 1L。

0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)：700mlH₂O 中溶解 186.1g Na2EDTA.2H₂O，用 10M NaOH 調(diào) pH8.0(需約 50ml)，補(bǔ) H2O 到 1L。

6、RNA 酶 A 母液：

將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisC· l(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加熱 15 分鐘，使混有的 DNA 酶失活。冷卻后用 1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于-20℃。